DNA paljundusaparaat on piisavalt väike, et hoida oma käes

BTS (방탄소년단) 'DNA' Official MV (Mai 2019).

Anonim

Kujutage ette "DNA koopiamasin", mis on piisavalt väike, et hoida oma käes, et tuvastada bakterid või viirus põhjustab infektsiooni isegi enne sümptomite ilmumist.

Seda võimalust tõstatab fundamentaalselt uus meetod, mis võimaldab juhtida võimsa, kuid õrna protsessi, mida nimetatakse polümeraasi ahelreaktsiooniks. PCR töötati välja 1983. aastal Kary Mullis, kes sai tema leiutise jaoks Nobeli auhinna. Üldiselt peetakse seda üheks olulisemaks arenguks molekulaarbioloogia valdkonnas, kuna see võib teha miljardeid identseid koopiaid väikestest DNA segmentidest, nii et neid saab kasutada molekulaarsetel ja geneetilistel analüüsidel.

Vanderbilti ülikooli biomeditsiinitehnikud Nicholas Adams ja Frederick Haselton pakkusid väljapoole kava ideed, mida nad nimetavad adaptiivseks PCRiks. See kasutab vasakukäelist DNA-d (L-DNA), et jälgida ja kontrollida molekulaarset reaktsiooni, mis toimub PCR-protsessis.

Vasakpoolne DNA on DNA-de peegelpilt kõigis elusolendites. Sellel on samad füüsikalised omadused nagu tavaline ja parempoolne DNA, kuid see ei osale enamikes bioloogilistes reaktsioonides. Selle tulemusena lisatakse fluorestseeruva märgisega L-DNA PCR-proovile, see käitub identsel viisil tavalise DNA-ga ja annab fluorestsentsvalgussignaali, mis annab teavet molekulaarsete reaktsioonide kohta ja neid saab kasutada nende kontrollimiseks.

Oma idee testimiseks võttis Adams ja Haselton tööle teadusliku professori füüsika professor William Gabella, et luua adaptiivse PCR-masina tööpõhine prototüüp ja seejärel katsetada seda laialdaselt biomeditsiini inseneriõppe astme Austin Hardcastle abiga.

Meetodi kirjeldust ja nende katsete tulemusi kirjeldatakse ajakirjas Analytical Chemistry ajakirjas avaldatud dokumendis "Adaptiivne PCR, mis põhineb peegelpildi L-DNA hübridisatsiooni tuvastamisel".

Kuigi tehnoloogiat peetakse üldiselt küpseks, on PCR-masinad osutunud keeruliseks toimimiseks ja on ülitundlikud väikeste muutuste suhtes proovide keemilises koostises ja keskkonnatingimustes. See on suuresti seetõttu, et pole olnud otsest võimalust jälgida, mis toimub molekulaarsel tasandil.

Selle tulemusel lubab PCR-i protsessi juhtimiseks kohanduv lähenemisviis muuta töö lihtsamaks, parandada selle töökindlust, vähendada tundlikkust keskkonnatingimuste suhtes ja vähendada töölaua ja pihuarvuti suurust. Sellest tulenevalt võib see vabastada PCR-i laboratoorsest seadest ja võimaldada sellel töötada kohapeal või ööpäevaringses kohas, kus seda saab kasutada DNA-allkirja erinevate haiguste tuvastamiseks.

Raskete laboritehnikute käimasolev PCR-tehnoloogia võitis Ernesto Llamas, Ph.D. Barcelonas põllumajanduse genoomika uurimiskeskuse üliõpilane, kes juhib karikatuid teaduse kohta tema Sketching Sciencei Facebooki lehel. Karikaturul, mille pealkiri on "PCR-protokoll", näitab ta uurijat, kes töötab proovi PCR-masinas. Paneelid pealkirjaga "saada reaktiivid, valmistada segu, seadistada tingimused, analüüsida geeli, negatiivne tulemus, nutma."

"PCR-seadmed on üsna kohmakad, " ütles Adams, andes näite: "Meie laboris on kolm kaubanduslikku PCR-masinat, mõnda aega ükski neist ei tööta. Kui me panime identselt ettevalmistatud proove kõigis kolmes masinas, siis kaks neist Töötasin ja ükski ei teinud. Kuna ma rääkisin selle probleemiga telefoni teel ühe ettevõtte tehnikutega, küsis ta mulle, kas probleemi masin oli seina kaheksa tolli ulatuses. Selgus, et see oli. Tehniku ​​sõnul on sein häiris masinaga õhuvoolu. See oli õige, sest kui ma sein sellest seinast välja, hakkas ta korralikult töötama! "

Laboratoorsed tehnikud on leidnud meetodid nende probleemide kompenseerimiseks. Masinaid hoitakse temperatuuri kontrollitavates ruumides. Nad puhastavad DNA proove nii, et neil on ühtlane keemiline koostis. Sellest hoolimata võib masinate optimeerimine uute allikate proovide käivitamiseks võtta operaatorite mitu nädalat. Ja isegi siis, kui neid optimeeritakse, viivad need proovid kolmes eksemplaris, kui üks neist ebaõnnestub.

Hindamaks Adamsi ja Haseltoni innovatsiooni, peate kõigepealt mõistma, kuidas PCR töötab.

PCR-i jaoks on vaja viit põhilist koostisosa: kopeeritav DNA-mall; praimerid, DNA lühikesed pinnad, mis käivitavad PCR-i reaktsiooni, mis on kavandatud seostuma DNA sektsiooni mõlemale küljele, mida soovite kopeerida; DNA nukleotiidi alused, DNA struktuuriplokid, mis on vajalikud uute DNA ahela loomiseks; DNA polümeraas, spetsiaalne ensüüm, mis genereerib uusi DNA ahelaid; ja puhvrit, mis tagab reaktsioonile sobivad keemilised tingimused.

Neid koostisaineid sisaldav proovi kuumutatakse kõigepealt selle keemistemperatuurini, kusjuures kaheahelaline DNA eraldub kaheks üheks ahelaks: protsess, mida nimetatakse denatureerimiseks. Seejärel jahutatakse proov proov temperatuurini, kus praimerid kinnituvad üksikutele ahelatele: protsess, mida nimetatakse lõõmutamiseks. Kui anniilimine on lõpule jõudnud, hakkab temperatuur tõusma ja DNA polümeraas hakkab automaatselt tekitama kaheahelalise DNA uue ahela loomist, kasutades üksikute ahelate mustreid: protsessi, mida nimetatakse pikendamiseks. Lõpptulemus on kahe originaalse kaheahelalise DNA kaks koopiat.

Protsessi lõppedes kordab tsükkel: temperatuur tõuseb jälle proovi keemistemperatuurile, põhjustades kahe kaheahelalise DNA eraldamise nelja üksikute ahelatega, mis toimivad matriitsina. Nii eksponeeritakse kaks koopiat DNAst neli eksemplari, neli eksemplari kaheksast eksemplari ja nii edasi. Tsüklit korratakse nii palju kui 30 kuni 40 korda, mis annab algse DNA segmendi kohta rohkem kui miljard täpseid koopiaid.

Temperatuur ja keemiline koostis on PCR-protsessi kriitilised tegurid. Proovi kuumutamise nõue täpsetele temperatuuridele on toonud kaasa keerukate küttesüsteemide ja raske isolatsiooniga PCR-masinate. Sellegipoolest võivad väikesed muutused õhuringluses ja toatemperatuuril välja tuua. Samamoodi võivad proovide keemilise koostise muutused oluliselt muuta erinevate etappide jaoks vajalikke temperatuure. Näiteks erinevused soolade, suhkrute ja alkoholide - kemikaalide puhul, mida tihtipeale kasutatakse proovide ettevalmistamisel - kõik võivad muuta temperatuuri, millega DNA-d kinnitatakse ja lahutatakse. Selle tulemusena peavad tehnikud läbima ulatusliku kalibreerimisprotsessi, et optimeerida kemikaalide ja tsüklite temperatuure, ning seejärel säilitada need tingimused iga uue valimi jaoks täpselt.

Adaptiivne PCR kallutab kõik need muutujad, tuginedes fluorestseeruvale L-DNA-le, et määrata lõõmutamiseks ja denatureerimiseks ideaalsed tsüklilised temperatuurid. L-DNA järjestused on kaubanduslikult saadaval. Nii et esimene samm on selleks, et L-DNA oleks sama järjestusega kui parempoolne DNA, mida soovite täiendada koos vasakukäeliste praimeritega. L-DNA-d tellitakse fluorestsentsvärviga ühel ahelal ja teisel ahelal "kustutajaga". Kuivatamine vähendab värvi fluorestsentsi. Niisiis, kuna L-DNA ahelad eraldatakse denatureerimisetapis, eraldatakse ka kustutaja ja värvaine, mis põhjustab fluorestsentsi taseme tõusu proovis. Analüüsides fluorestsentsi taseme muutuse määra, saab mikroprotsessor kindlaks teha, kui peaaegu kogu DNA on eraldatud.

Samamoodi on vasakpoolsete praimerite külge kinnitatud värvaine kustutaja. Kuna protsess liigub anniilimise etappi ja praimerid kinnituvad L-DNA ahelatele, vabastavad nad kustutavad L-DNA fluorestseeruv värvaine. See annab hämarasignaali, mida saab analüüsida, et tuvastada punkt, kui praimerid on kinnitatud peaaegu kõikide DNA ahelate külge. L-DNA kogus proovis muutub tsükli jooksul tsüklisse, kuna see ei osale amplifikatsioonietapis.

Uurijad teatavad, et katse prototüübi süsteemiga on näidanud, et see meetod dubleerib tavapäraste PCR-masinate tulemusi kontrollitud tingimustes ja võib DNA-d tõhusalt võimendada tingimustel, mis põhjustavad standardse PCR-i ebaõnnestumist. "Need eelised võimaldavad PCR-põhist diagnostikat paremini kättesaadavaks teha väljaspool hästi kontrollitud laboratooriume, näiteks hoolduspunkte ja välistingimusi, millel puuduvad ressursid reaktsiooni temperatuuri täpseks kontrollimiseks või kõrge kvaliteediga proovide ettevalmistamiseks."

Vanderbilti Ülikool on taotlenud adaptiivse PCR-i patenti ja selle esindajad on aktiivselt arutanud mitme tehnoloogia litsentsimisega tegelevat ettevõtet.

menu
menu